神经管缺陷（NTD）是我国排名靠前的重大出生缺陷之一，由胎儿神经管闭合障碍造成中枢神经发育畸形，包括无脑儿和脊柱裂等^[1]。随着测序技术的发展，在散发NTD病例中检测出大量致病位点（Pathogenic Variants, PV）以及致病性不明确位点（Variant of Unknown Significant, VUS）。如何确认这些稀有突变，尤其是VUS的致病性是遗传病研究面临的共同挑战。模式动物，尤其是携带人源突变的小鼠（Humanized Pathogenic/VUS Variant Knock-In Mouse, HV-KIM）能否复现对应的疾病表型，是突变位点致病性评估的金标准。但传统HV-KIM造模方式受制于突变位点对育性和致死性的影响，难以高效快捷地获得研究需求的小鼠模型^[2]。

近日，复旦大学附属妇产科医院/代谢与整合生物学研究院王红艳教授课题组、中国科学院分子细胞科学卓越创新中心李劲松院士团队和贝勒医学院雷云平助理教授合作研究，在Science Bulletin发表了题为The interaction of Endorepellin and Neurexin triggers neuroepithelial autophagy and maintains neural tube development的研究论文。该研究运用类精子干细胞结合基因编辑的半克隆技术，突破了传统造模限制，快速批量构建了HV-KIM小鼠模型，揭示了从串珠蛋白聚糖Perlecan中切割而来的活性分泌蛋白Endorepellin突变体致NTD发生的机制。

研究团队通过测序发现10%的NTD病例（n=369）携带Perlecan（HSPG2）基因的稀有突变(PV/VUS)，而对照样本中携带相应稀有突变的比例为4%（n=200）。Hspg2基因敲除小鼠表现出严重NTD表型而发生胚胎致死。明确这些PV/UVS变异位点在NTD中的致病性及其致病机制是转化应用的前提。合作团队利用半克隆技术结合CRISPR/Cas9基因编辑工具，在半年内构建出19个HV-KIM小鼠品系。尽管在NTDs样本中检测到的HSPG2突变分散在整个基因中，但HV-KIM小鼠的表型分析表明，NTD致死性突变集中在Perlecan的V区结构域，即Endorepellin短肽中。

Endorepellin已被报道对血管内皮细胞有调节功能^[3]，但其在神经管闭合中的作用及其机制尚不清楚。研究团队发现Endorepellin可以被神经上皮细胞的膜蛋白受体Neurexin识别，以及Endorepellin和Neurexin的相互作用对于促进神经上皮细胞高水平的自噬、抑制神经干细胞过早分化以及维持正常神经管发育是必要的。研究者进而借助半克隆技术的优势，通过构建Hspg2基因的原位标签小鼠，以及在体的Hspg2/Neurexin2双基因标签小鼠，首次在体内鉴定到Endorepellin短肽的存在和分泌区域；在体水平检测到Endorepellin和Neurexin的互作，证明Endorepellin和Neurexin的相互作用可触发神经上皮自噬并促进神经管闭合（图1）。鉴于HSPG2致病突变引起的自噬激活受阻和神经元分化抑制紊乱被发现是NTD发生的决定性因素，而神经元干细胞过早分化可增加NTD的风险，这一发现提示，神经干细胞早期分化的抑制剂或可具有潜在的NTD预防价值，用于预防携带致病性HSPG2变异位点或Endorepellin功能紊乱导致的NTD的发生。

图1 Endorepellin和Neurexin互作并通过内吞作用触发自噬，抑制神经干细胞向神经元的分化，维持正常的神经管闭合；

Endorepellin突变体无法有效促进自噬以及抑制神经干细胞的过度分化，导致NTD的发生

该研究中对NTD发生机制的新认知源于类精子干细胞干性和育性并存的特性结合CRISPR/Cas9基因编辑的技术突破，这一技术在HSPG2突变致病性确认及Endorepellin机制解析中的成功应用，为确定NTD及其他复杂致死性出生缺陷的致病性突变研究提供了范例。

复旦大学附属妇产科医院/代谢与整合生物学研究院王红艳教授、中国科学院分子细胞科学卓越创新中心李劲松研究员及贝勒医学院雷云平助理教授为该论文的通讯作者；复旦大学代谢与整合生物学研究院卢磊青年副研究员、耶鲁大学医学院白梅竹博士后为共同第一作者。该研究工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金及上海市科委等相关科研项目的资助支持。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.scib.2024.03.026

参考文献：

1. Greene ND, Copp AJ. Neural tube defects. Annu Rev Neurosci. 2014; 37: 221-42.

2. Lei Y, Finnell RH. New Techniques for the Study of Neural Tube Defects. Adv Tech Biol Med. 2016 Feb; 4(1): 157.

3. Poluzzi C, Iozzo RV, Schaefer L. Endostatin and endorepellin: A common route of action for similar angiostatic cancer avengers. Adv Drug Deliv Rev. 2016 Feb 1; 97: 156-73.